仙草堂提醒：鹿茸Ⅰ型胶原的提取及在细胞培养中的应用

　 鹿茸作为临床治疗药物，在我国的应用有几千年的历史。研究表明，鹿茸中含有大量的I型胶原鹿茸。胶原是蛋白质的一种，是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，是天然存在的具有很高利用价值的生物物质鹿茸。尤其对细胞的固定附着及改善生长表面的特性有很好的作用，因此，近年来胶原被广泛应用于各种细胞的分离和培养[3 4]。本文以鹿茸为原料，制备Ⅰ型胶原并对其在细胞培养中的应用进行了初步研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 鹿茸鲜鹿茸由吉林东丰药业提供。

　　1.1.2 细胞系非洲绿猴肾细胞Vero及人宫颈癌细胞Hela为长春生物制品研究所惠赠；小鼠成纤维细胞L929为东北师范大学惠赠。

　　1.1.3 试剂高分子量标准蛋白为Amersham Biosciences UK公司产品；DMEM培养液、小牛血清为Gibco产品；胰蛋白酶（活力1：250）、MTT（噻唑蓝）购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

　　1.1.4 实验仪器高速组织捣碎机DS-1，上海标本模型厂；台式低速大容量离心机TDL-5，上海安亭科学仪器厂；冷冻干燥机LL3000，Heto；倒置生物显微镜XSB-1，中国广西梧州市光学仪器厂；二氧化碳培养箱HERAcell150，Heraeus；酶标仪Multiskan MK3，Thermo。

　　1.2 方法

　　1.2.1 胶原的制备取新鲜鹿茸500g，剥皮，去肉，4℃将血控净，切成1 cm3小块，4℃蒸馏水洗至无血色，高速组织捣碎机匀浆，加60%乙醇1000 ml，4℃浸提48 h，纱布过滤，离心，上清液于50℃，60 rpm旋转蒸发回收乙醇，提取液置于截流分子量范围8-15 kDa的透析袋中，对蒸馏水透析24 h，-20℃预冻24 h，冻干，即得鹿茸胶原。

　　1.2.2 SDS-PAGE电泳按文献方法鹿茸，采用浓度为10%的分离胶和浓度为5%的浓缩胶，浓缩胶电压为70 mv，分离胶电压140 mv。采用考马斯亮蓝R250进行染色，最后用脱色液（甲醇：冰醋酸：水=4.5：4.5：1）脱色，至背景清晰，观测分子量范围。

　　1.2.3 氨基酸分析取胶原冻干品约25 mg，2 ml 6mol/L HCl水解24 h，蒸干, 由吉林大学测试中心, 采用安捷伦公司1100系列高效液相进行氨基酸含量测定。衍生试剂：2,4-二硝基氟苯(FDNB); 流动相A：乙腈：水（55：45）；流动相B：KH2PO4，pH=7.2; 梯度洗脱，流速1 ml/min，进样量10 μl。

　　1.2.4 胶原包被称取20 mg胶原, 加200 ml PBS缓冲液(pH7.0)，于90 ℃水浴1 h, 取上清液分装, - 20 ℃保存。将冰存的胶原液在室温下解冻, 用吸管吸取胶原液在无菌的培养板孔底均匀铺薄薄一层，置超净台内鼓风晾干, 紫外照射过夜, 备用。

　　1.2.5 MTT法检测细胞增殖将处于对数生长期的Vero细胞、L929细胞及Hela细胞，分别用0.25%的胰蛋白酶消化，再用培养液 (含10%小牛血清、1%双抗的DMEM) 调细胞密度为5×105/ml，分别接种在已包被和未包被的培养板，100μl/孔，设20个复孔。于37℃、5%CO2中培养48h后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的MTT。再培养4h，将孔内液体吸净，每孔加入150μl DMSO，微孔震荡仪上震荡至深蓝色结晶完全溶解，于Multiskan MK3 Thermo 酶标仪，450nm处测各孔OD值。结果以 ±S表示，数据采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 氨基酸分析

　　由结果显示在20种常见氨基酸中，甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量最高，其中甘氨酸含量几乎占了1/3，为32.24%，脯氨酸和丙氨酸含量分别为12.64% 和 10.78%；组氨酸和酪氨酸含量较低，没有检测出胱氨酸；非常见氨基酸—羟脯氨酸的含量也非常高，为10.20%。结果与文献报道的胶原氨基酸特点相符鹿茸。另外，羟脯氨酸和脯氨酸比值为0.8。

　　2.2 SDS-PAGE 电泳

　　结果表明鹿茸胶原的分子量分布集中在两部分，一部分在100 kDa-200 kDa之间，为两条分子量相近的蛋白带；另一部分在200 kDa以上。

　　2.3 胶原包被对细胞生长的影响

　　在培养48后，对各组细胞进行MTT测定，结果显示，包被板的吸光度明显高于未包被板。其中，培养L929细胞的包被板最为显著。

　　3 讨论

　　在胶原的提取、分离过程中，由于方法和条件不同，会产生胶原、明胶和胶原蛋白三种产物，它们在结构和性能上存在较大的差别。能被称为胶原的，必须是其三螺旋结构没有改变的那类蛋白质。胶原成膜能力最强，在生理条件下，胶原分子之间能再度相互连接形成纤维，能明显激活细胞的生长，相对分子质量在10万以上，分布很窄。而明胶和胶原蛋白是胶原的变形、水解产物，不具三股螺旋结构，成膜性差或不能成膜，不具有促进细胞生长的性质，分子量低，并且分布很宽鹿茸。通过SDS-PAGE电泳方法，我们所提取的胶原的分子量分布范围在10万以上，应属于胶原。

　　至今已发现19 种不同类型胶原，这些胶原在组织内的分布具有一定特异性，皮肤和骨组织中主要为Ⅰ型胶原鹿茸。各型胶原都含有羟脯氨酸和羟赖氨酸，但各型胶原的羟脯氨酸和脯氨酸的比值不同，Ⅰ型胶原为0.7～0.8鹿茸。我们测得的这一比值为0.8，由此可以看出，我们提取的鹿茸胶原应为Ⅰ型胶原。

　　Ⅰ型胶原主要是由3条α1(I)链组成，即α1(I)3，也有部分Ⅰ型胶原是由两条α1(I)链和一条α2(I)链组成，即α1(I)2 α2(I)。每条肽链有1000个左右氨基酸残基，相对分子质量100 kDa左右，α1的分子量略大于α2鹿茸。因胶原分子氨基酸组成中缺乏半胱氨酸，因此，每条链之间不可能像其它蛋白那样以二硫键相联，而是通过组氨酸与赖氨酸间的共价交联。因此，胶原在SDS-PAGE电泳中，不会因β－巯基乙醇（打开蛋白质中的二硫键，使蛋白质解聚）的存在而被解聚成单链，检测到分子量应为300 kDa左右。但在本实验中可以看到，在100 kDa－200 kDa之间，存在两条分子量相近的蛋白带，应为Ⅰ型胶原的α1(I)链和α2(I)链。这可能是因为在进行SDS-PAGE电泳时，为使蛋白链尽可能伸展并与SDS充分结合，必须对样品采用沸水加热的办法，此步骤可能造成了胶原的部分水解；也可能是在胶原提取过程中，发生了部分水解。值得注意的是，不管由于哪种原因造成了胶原水解，这种水解都应是比较温和的。这是因为从电泳结果上看，并未出现分子量小于100 kDa的蛋白带，表明水解仅造成α1(I)链和α2(I)链的释放，而每条单链本身并未被水解，结构都很完整。

　　我们的研究还显示，用鹿茸Ⅰ型胶原包被培养板后，培养的细胞的生长繁殖能力明显优于在未包被培养板上的培养效果；在L929、Hela和Vero细胞中，鹿茸Ⅰ型胶原包被更有利于L929细胞的生长。这表明，鹿茸Ⅰ型胶原明显能够改善多种细胞的贴壁和增殖。但是，对于不同的细胞，改善的程度是不同的。